树突状细胞（DC细胞）与T细胞之间的相互作用在肿瘤治疗中具有重要意义。研究表明，骨髓来源的DC细胞（BMDCs）能够诱导CD103+CD8+组织驻留记忆T细胞亚型的产生，从而增强生殖道局部肿瘤的控制效果。此外，半乳糖酸的阻断也显著提高了BMDCs诱导的抗原特异性CD8+T细胞的增殖能力。通过全转录组基因表达分析发现，仿硅酸处理的BMDCs能够诱导与T细胞活化、细胞粘附及细胞间相互作用相关基因的差异表达。细胞聚类测定及单细胞嗜性测量显示，糖基化减少的BMDC与CD8+T细胞之间的嗜性相互作用显著增强。DC细胞在完成抗原呈递后，如何在CD8+T细胞激活和靶细胞杀伤中发挥协同作用，以及调控其功能，成为当前研究的热点之一。同时，活化CD8+T细胞的记忆功能变化与其细胞内的乳酸化、棕榈酸化以及代谢过程之间的关系正在受到关注。这些研究几乎都需要评估CD8+T细胞的杀伤功能，本期小E将为大家介绍DC细胞激活的CD8+T细胞及其杀伤功能的检测解决方案。

实验原理简介：DC细胞被公认是功能最为强大的抗原呈递细胞（APC），它们能够摄取并消化外源抗原，并通过MHC分子将其呈递给CD4+和CD8+T细胞，进而引发免疫反应。通过共培养DC细胞与CD8+T细胞，能够有效模拟体内CD8+T细胞的激活，成为CD8+T细胞相关研究的重要模型方案。在抗原肽-MHCⅠ复合物的DC细胞与CD8+T细胞共培养时，CD8+T细胞通过表面的T细胞受体（TCR）与DC细胞上的抗原肽-MHCⅠ结合，从而被激活。激活后的CD8+T细胞（也称为细胞毒性T细胞）可通过分泌介质（如穿孔素及颗粒酶）对靶细胞进行杀伤，也可通过T细胞表面Fas配体（FasL/CD95L）与靶细胞Fas受体（CD95）结合，触发Caspase-8的激活，直接启动靶细胞的凋亡过程。（PMID:34725504）

实验结果展示：DC细胞的体外培养与促成熟，流式细胞术检测显示，在体外诱导C57小鼠的骨髓细胞为成熟的DC细胞后，MHCII/CD80/CD40/CD86的表达显著增加。 CD8+T细胞的分选及抗原呈递与激活培养，使用EasySort™MouseCD8+TCellIsolationKit从C57小鼠脾脏中分选CD8+T细胞，经过流式细胞术分析其细胞纯度。接下来，用灭活的靶细胞（Raw2647）进行抗原装载DC细胞，然后与分选的CD8+T细胞共培养72小时，以检测CD8+T细胞的增殖。针对CD8+T细胞杀伤靶细胞的凋亡检测，共培养后的T细胞与靶细胞（Raw2647）按1:10的比例共培养24小时，流式细胞术检测靶细胞中Caspase3酶活性的变化，结果显示共培养组（Test）中Raw2647细胞的Caspase3酶被激活比例达到7944%。同时，ELISA检测显示，培养上清中的细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α的表达量与Control组相比均明显增加。

实验方案及操作流程：DC细胞的体外培养与促成熟，首先取小鼠的骨髓细胞，在分化培养基中培养6天后，再用成熟培养基培养24小时，成功获得成熟的DC细胞。详细的操作流程可参考“Mouse Bone Marrow-derived Dendritic Cells (BMDC) Induction and Identification Kit”（货号：XJM003）。然后，将Raw2647细胞在80℃水浴中处理4小时，即可完成灭活处理。接着，按1:1的比例将灭活的Raw2647细胞与成熟的BMDC细胞共培养24小时，收集并计数细胞。接下来，通过EasySort™MouseCD8+TCellIsolationKit从C57小鼠脾脏中分选CD8+T细胞，并检测细胞纯度。随后，加CFSE染色液标记后，按10:1的比例将CFSE标记的T细胞与BMDC细胞混合均匀，培养72小时。同时设置CFSE标记的T细胞为Control组，并在共培养期间每24小时补加二分之一体积的1640全培养基。在细胞增殖和聚团显著增加后，记录并汇总实验结果。

CD8+T细胞杀伤靶细胞的凋亡检测步骤为：在24孔板中接种靶细胞（Raw2647细胞），混合T细胞与靶细胞（Raw2647细胞）按2:1比例，共培养24小时后，收集和洗涤细胞。同时留取细胞上清备用，并加入Caspase3流式底物和ElabFluor® Violet450抗体共同染色，最后进行流式细胞分析，检测细胞中Caspase3的酶活情况。

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