糖蛋白在人体蛋白质中占据超过50%的比例，是大多数生物医药产品的重要组成部分。作为翻译后修饰（PTM）中最常见且复杂的一种，糖基化在调节多种生物过程方面发挥着关键作用。对糖蛋白一级序列的深入分析，包括糖基化位点的鉴定和相关的聚糖结构，是理解其功能的核心。

液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）现已成为蛋白质鉴定和翻译后修饰研究的重要工具。与传统的数据库搜索策略不同，从头测序为糖蛋白质组学提供了一种创新的方法，无需事先的DNA或氨基酸序列信息。然而，多糖基化位点的复杂性往往导致序列覆盖不完整和游离寡糖修饰谱不明确，从而使得获得足够信息的糖肽碎裂谱变得困难。这种广泛的糖基化现象经常在特定区域出现空缺，制约了从头测序在单克隆抗体（mAb）中应用的有效性，特别是在具有一致结构和已知N-link糖基化位点的抗体中。

2025年发表的一项研究探讨了通过综合质谱法解码蛋白质糖基化的全新策略，提出了一种结合糖基释放介导的从头测序与糖基化位点表征的方法。作者通过去糖基化技术实现全面的序列覆盖，结合EThcD碎裂技术得到了高质量的长肽，进一步增强了准确的蛋白质组装能力。此方法还被应用于复杂糖基化融合蛋白依那西普及三种序列未知的新型肿瘤坏死因子受体：Fc融合生物制剂的从头测序，揭示了一级序列的微小差异，并在亚基、糖肽和聚糖层面上表征了这些蛋白质的N和O糖基化修饰。这一新策略有效弥补了从头测序和糖基化修饰之间的空白，为糖蛋白的精准测序提供了可靠的解决方案，具有广泛的基础研究和生物医药行业应用价值。

具体的研究方法包括：使用N-糖苷酶F（PNGaseF）去除N-聚糖，内切α-N-乙酰半乳糖胺酶（EngEF）去除O-聚糖，并结合唾液酸酶，确保去糖基化的效果。通过完整的质量分析确认去糖基化结果，采用电子转移高能碰撞解离（EThcD）技术获取高质量肽段，使用PEAKSAB分析其序列。同时，采用含18O环境的PNGaseF酶解将糖基化Asn转换为Asp并进行标记的定量分析。此外，使用内切糖苷酶混合物处理样本，以分析带有“GlcNAc”或“GlcNAc-Fuc”修饰的产物，从而验证N-糖基化位点的鉴定结果。这些研究方法的结合，进一步增强了糖蛋白的从头测序能力。

在依那西普及三种未知TNFR:Fc融合生物制剂的研究中，开发的从头测序方法被广泛应用，进行糖基化修饰区域的深度覆盖，并揭示了与依那西普的细微氨基酸序列差异。这进一步验证了从头测序方法在高度糖基化生物制药中的可靠性及其重要性。

为了有效地确定N和O糖基化，采用了多层次的分析方法，对糖基化位点进行了细致的识别和游离寡糖的分析，确保了对N-糖基化的全面了解。研究者通过UPLC-HILIC-FLR-MS技术，对酶促释放的N-糖进行识别和量化，获得依那西普中含量最丰富的N-糖型结果，这为糖基化表征提供了宝贵的数据。此外，结合质谱检测策略，研究揭示了TNFR：Fc生物药的糖基化特征，包括不同位点的糖基变异，为未来生物医药产品的开发奠定了基础。

综上所述，基于质谱的蛋白质从头测序技术是揭示氨基酸序列及其糖基化修饰的重要工具，整合糖苷酶酶解与EThcD技术显著提高了测序准确性，开启了对高度糖基化蛋白质更深入的研究路径。通过对依那西普的分析，不仅提供了全面的信息，还有效阐明了糖基化位点和糖型异质性的复杂性。这为生物制药行业的发展奠定了坚实的基础，尤其是在治疗各种疾病的药物研发方面，充分展示了尊龙凯时在推动生物医药创新中的领先地位。