细胞融合是生物医学研究中的一种重要技术，主要用于产生单克隆抗体等应用。常用的细胞融合方法包括转动法和离心法。在进行细胞融合时，通常采用脾细胞与骨髓瘤细胞的比例为1:1至10:1，其中3:1或5:1的比例最为常见。

试剂与材料

进行细胞融合所需的试剂和材料包括：

• 供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。
• 1640培养液100ml。
• 完全1640培养液100ml。
• 25% FCS－1640培养液50ml。
• HAT培养液100ml。
• 50% PEG：取分子量为4000的高纯度PEG（如日本进口或Serva），准备10g，放入25ml瓶中高压灭菌。在使用之前，将10ml预热至40℃的1640液与PEG以等量混合，并检查pH值，通常无需调节。如pH值有变，可用HCl或NaHCO3进行调整。
• 灭菌沉淀管或瓶（10ml和50ml）。
• 40孔塑料培养盘。

操作方法

细胞融合的操作过程如下：

1. 准备脾细胞。
2. 在50ml沉淀管中混合108个脾细胞和107个小鼠骨髓瘤细胞，加入50ml 25% FCS－1640液。
3. 在室温下以400g离心3分钟，使细胞沉淀。
4. 小心移去上清液。
5. 轻敲管底部使沉淀流动，将沉淀管放置于40℃水浴中以达到融合温度。
6. 逐渐加入8ml预热至40℃的50% PEG，用1ml吸管缓慢滴加，同时摇动沉淀管，观察颗粒的出现，滴加过程持续2分钟。
7. 再加入1ml的1640液并摇动，持续1分钟。
8. 重复上一过程一次。
9. 再次加入1ml的1640液并摇动，持续0.5分钟。
10. 重复上一过程一次。
11. 加入15ml1640液。
12. 在室温下以400g离心1分钟，使细胞沉淀。
13. 轻轻去除上清，加入25ml含有HAT的完全1640液。
14. 将融合的细胞液以每孔1滴（约0.05ml）的量滴加到预先种有饲养细胞的40孔塑料培养盘中。
15. 轻轻摇匀后，将其放入5% CO2湿度饱和的37℃培养箱中进行培育。
16. 在第3、6、9及10天时更换为含有HAT的完全1640培养液。注意轻柔吸取上清，避免吸出固定在孔底的细胞，并根据需要加入适量的饲养细胞。
17. 在第12和15天再加入一次含有HAT的完全1640培养液。每次换液前，使用倒置显微镜观察，通常在大约10天内可观察到杂交瘤细胞的生长，大部分细胞在10至20天内形成，但也有可能需要约1个月。
18. 一旦杂交瘤细胞出现，需吸取上清液并进行抗体检测。
19. 对持续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代的过程中，可视情况使用10% FCS－1640液替代HAT液和完全1640液。同时，将细胞保存于液氮并进行克隆化，并在此期间每代都需检查抗体，以防止抗体细胞的变异及丢失。

通过上述方法，您可以有效地进行细胞融合实验，产生理想的杂交瘤细胞，满足不同研究和产品开发的需求，借助尊龙凯时的高品质试剂和技术支持，使您的实验更加顺利和高效。