一、同源重组法质粒构建

同源重组法质粒构建在基因功能研究及蛋白表达与纯化等方面具有众多应用。其内容涵盖基因的敲除、敲低及过表达等，为研究基因功能、表达调控机制以及其对细胞生理过程与表型的影响提供了有效手段。此外，通过优化启动子、核糖体结合位点等表达元件，结合选择合适的宿主细胞，利用同源重组法构建表达载体，实现目的蛋白在宿主细胞中的大量表达，以达到高效表达和纯化的目的。与传统的酶切法依赖于限制性内切酶对DNA的特异性切割不同，同源重组法是基于DNA分子间的同源序列进行重组。因此，本文将重点介绍同源重组法质粒构建的实验步骤。

二、流程图

三、材料与仪器

所需材料包括：目的片段的cDNA、引物、载体、限制性内切酶、酶切buffer、LB培养基、含LB培养基的细菌培养皿、同源重组酶、高保真酶、感受态细胞DH5α、胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、EP管、离心管、移液枪及枪头等。

四、实验步骤

同源重组法构建质粒的步骤如下：

1. 根据目的片段的酶切位点选择相应的内切酶，通过双酶切法将环状载体质粒切割成线性化载体，再利用琼脂糖凝胶法回收酶切产物，具体回收方法参照试剂盒操作。
2. 采用PCR技术扩增目的片段的序列，并通过琼脂糖凝胶法回收扩增产物。
3. 将线性化的载体与扩增的片段按比例连接，反应条件为37℃下进行30分钟或更长时间（1~2小时）。将连接好的重组质粒（10μl）转入克隆感受态细胞DH5α，轻轻吹打均匀，避免振荡，冰上静置30分钟，随后在42°C水浴中热激90秒，立即置于冰上静冷却2~3分钟。
4. 加入500μl不含抗生素的LB液体培养基，37℃下摇菌1小时，转速250rpm。
5. 将上一步的菌液以5000rpm离心5分钟，弃去300μl上清液。用剩余的培养基重悬菌体，建议按不同梯度涂板，以防单克隆菌过于密集或稀疏，使用无菌涂布棒在含有质粒抗性的平板上均匀涂布后，放入37℃培养箱中培养10~12小时。
6. 过夜后，取1μl枪头挑取单克隆菌，置于5ml含抗生素的LB液体培养基中，继续培养10~12小时。
7. 利用质粒小提试剂盒提取菌液中的重组质粒后，使用限制性内切酶消化并进行琼脂糖电泳进行酶切鉴定。
8. 在第7步进行的同时，吸取部分菌液进行菌液PCR，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的条带大小，以进一步验证重组质粒的正确性。
9. 将通过鉴定的菌液送至测序公司进行双向测序，待序列结果比对验证正确后，即表示重组质粒构建成功，可以进行后续实验。

五、实验相关产品推荐

产品名称及货号如下：

• 质粒小提试剂盒 - QIAprep Spin Miniprep Kit - 凯杰 Qiagen - 详询
• 孔酵母质粒小提试剂盒 - Zymoprep-96 Yeast Plasmid Miniprep - Zymo Research - 详询
• 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 - 简石生物 - 详询

以上产品均可通过尊龙凯时进行咨询与购买，欢迎与我们联系以解决您的产品及技术问题！

北京百奥创新科技有限公司是一家专注于免疫学、细胞生物学、分子生物学等领域核心试剂产品的研发、生产与销售的高新企业。作为中关村高新技术企业，自2017年在北京成立以来，百奥创新依托于中科院的科研力量，以中科院资深科学家为核心，整合经验丰富的商业与管理团队。我们不仅致力于自主研发产品，还与全球多家生命科学试剂供应商保持良好合作关系，基于“客户第一”的核心理念，为全国10000+客户提供20000+优质产品。百奥创新将以品质建设品牌，以服务赢得口碑，致力于成为生物原料及生物化学试剂开发与成果转化的领军者，成为行业领先的优质供应商。